常用菌種的傳代與保存方法菌種的傳代與保存 _生活經(jīng)驗

【常用菌種的傳代與保存方法菌種的傳代與保存】一、菌株概念及傳代
（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株：直接從官方菌種保藏機構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認(rèn)為第0代菌株。
（2）標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實驗室轉(zhuǎn)接一代后得到的一套完全相同的獨立菌株。通常為第1代或第2代菌株。
（3）儲備菌株：從標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的培養(yǎng)物。通常為第2代或第3代菌株。
（4）工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株、儲備菌株或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（經(jīng)證明或未經(jīng)證明）轉(zhuǎn)接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。
傳代：每一次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)都是一次傳代的過程，可以使用液體、固體或半固體培養(yǎng)基。
注意事項：菌株傳代只能由上往下傳，儲備菌株可以做為工作菌株使用，但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實驗室使用的工作菌株一般不可超過第5代，除非標(biāo)準(zhǔn)方法中有明確要求，或?qū)嶒炇夷軌蜃C明菌株相關(guān)特性沒有改變。若在傳代過程中出現(xiàn)明顯變異，也不可繼續(xù)使用。
二、菌種保存的基本原理
使微生物的生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài) ，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低范圍內(nèi) 。干燥、低溫和隔絕空氣是保證獲得這種狀態(tài)的主要措施。有針對性地創(chuàng)造干燥、低溫和隔絕空氣的外界條件，就是微生物菌種保藏的基本技術(shù) 。
三、菌種保存的常用方法（1）斜面保存法操作方法：將營養(yǎng)瓊脂（或其他適宜的瓊脂培養(yǎng)基）加熱煮沸溶解后分裝至試管中，滅菌后擺長斜面凝固，挑取菌落“之”字形劃線接種至培養(yǎng)基斜面，置于合適的條件中進行培養(yǎng) 。培養(yǎng)結(jié)束后，置2-8℃冷藏保存（部分菌株會在4℃產(chǎn)生自溶，如銅綠假單胞菌。副溶血性弧菌等，可置室溫保存）。此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，操作簡單，使用方便，但易變異，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機會亦較多。霉菌、酵母菌、放線菌和芽孢菌一般保存2-4個月傳代一次，細(xì)菌一般保存一個月傳代一次。

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斜面保存法
（2）液體石蠟保存法操作方法：將營養(yǎng)瓊脂（或其他適宜的瓊脂培養(yǎng)基）加熱煮沸溶解，分裝至試管中滅菌后擺長斜面，或使用半固體培養(yǎng)基加熱煮沸溶解后分裝至小試管，滅菌后擺直立，挑取菌落“之”字形劃線接種至培養(yǎng)基斜面或穿刺接種至半固體培養(yǎng)基管，置于合適的條件中進行培養(yǎng) 。培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)基表面覆蓋一層無菌液體石蠟， 2-8℃冷藏保存。液體石蠟一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。此法比斜面保存法的保存期限更長，霉菌、酵母菌、放線菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更長時間，多數(shù)無芽孢菌也可保存到一年以上。（3）甘油凍存保存法操作方法：挑取菌落至液體菌種保存管中（商品化的液體菌種保存管中已加入甘油，直接使用即可；若自行配制，可在凍存液中加入15%-50%比例的甘油，或?qū)⒕号c無菌甘油溶液混合），用移液槍吹打均勻，制成約109CFU/mL的菌懸液，置于超低溫冰箱中或液氮罐中冷凍保存（霉菌可挑取孢子凍存，保存溫度越低效果越好，長期保存建議在-70℃以下凍存）。該方法適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。-20℃保存時間較短，一般可保存一年左右，-70℃以下可保存較長時間，一般至少可保存兩年以上，有些菌種甚至可保存十年以上。注意事項：反復(fù)凍融易導(dǎo)致菌株死亡，在中國藥典中規(guī)定，融化后的菌種保存管不可再進行冷凍保存。

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液體菌種保存管（含甘油）
（4）真空冷凍干燥保存法通常以牛奶為載體，加入菌株制成菌懸液，使用真空凍干機器進行脫水凍干處理，制成凍干粉。相比較于其他保存方法，真空冷凍保存法更容易保存菌種的活力，延長保存時間，適用于98%以上菌種的保存，但操作復(fù)雜，一般實驗室難以使用。（5）載體保存法以沙土、濾紙、硅膠等材料做為載體吸附菌株，通過五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏時間長，應(yīng)用較為廣泛，但一般實驗室通常不易操作。（6）瓷珠保存法瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器，管內(nèi)有表面凹孔小瓷珠用于細(xì)菌的吸附和保存，甘油做為抗凍保護劑可減少冷凍過程中形成的冰晶，瓷珠菌種保存管放置于-20℃或-80℃下便可創(chuàng)造干燥、低溫、缺營養(yǎng)的環(huán)境，使菌株處于“休眠” 狀態(tài) ，方可長期保存（視不同菌種與保存溫度，一般可保存3-10 年），同時菌種保存管的取用和保存較為便利（取用復(fù)蘇及保存菌株僅需1 分鐘）。保存方法：挑取平板或斜面上的新鮮純培養(yǎng)物于菌種保存管中，配成大約3-4麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙海w上蓋子來回顛倒幾次使細(xì)菌乳化，用無菌移液器將菌種保存管內(nèi)的液體吸取干凈，僅留下瓷珠，擰緊保存管，迅速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。使用方法：無菌條件下，用滅過菌的針或者鑷子取出一個小瓷珠，將小瓷珠直接用作平板劃線或加到合適的液體培養(yǎng)基中，置合適的條件下進行培養(yǎng)即可。

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瓷珠菌種保存管
四、實驗室常用菌種的保存方法
（1）短期、中期保存：葡萄球菌、沙門氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、假單胞菌、李斯特氏菌等，可使用營養(yǎng)瓊脂斜面或TSA斜面4℃保存（銅綠假單胞菌在4℃會出現(xiàn)自溶，可以置室溫保存），通常可保存1-3個月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖瓊脂斜面4℃保存，通常可保存3-6個月。生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌可使用皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)后置4℃保存，可存活數(shù)月至1年以上。（2）長期保存：對于大多數(shù)的細(xì)菌、真菌，普通實驗室都可以選用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下凍存，溫度越低保存時間越長。（注：保存霉菌時挑取孢子凍存即可；保存厭氧菌建議使用甘油保存法，避免反復(fù)凍融；使用甘油凍存法保存彎曲桿菌、螺桿菌、嗜血桿菌等細(xì)菌時，加入5%-10%比例的脫纖維羊血效果更佳）。
注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。
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常用菌種的傳代與保存方法 菌種的傳代與保存

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